Fumarate는 선천적 면역을 유도하기 위해 mtDNA의 소포 방출을 유도합니다.

Nature 615권, 499~506페이지(2023)이 기사 인용

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측정항목 세부정보

푸마르산염 수화효소(FH)의 돌연변이는 유전성 평활근종증과 신장 세포 암종을 유발합니다1. 신장에서 FH의 손실은 oncometabolite fumarate2의 축적을 통해 여러 발암성 신호 전달 계통을 유도합니다. 그러나 FH 손실의 장기적인 결과가 설명되었지만 급성 반응은 지금까지 조사되지 않았습니다. 여기서 우리는 신장에서 FH 손실의 연대기를 연구하기 위해 유도 가능한 마우스 모델을 생성했습니다. 우리는 FH의 손실이 미토콘드리아 형태의 초기 변화와 미토콘드리아 DNA(mtDNA)가 세포질로 방출되어 인터페론 유전자 자극제(STING)인 순환 GMP-AMP 합성효소(cGAS)의 활성화를 촉발한다는 것을 보여줍니다. TANK 결합 키나제 1(TBK1) 경로는 레티노산 유도성 유전자 I(RIG-I)에도 부분적으로 의존하는 염증 반응을 자극합니다. 기계적으로, 우리는 이 표현형이 푸마르산염에 의해 매개되고 넥신 9(SNX9) 분류에 의존하는 방식으로 미토콘드리아 유래 소포를 통해 선택적으로 발생한다는 것을 보여줍니다. 이러한 결과는 세포내 푸마르산염의 증가된 수준이 미토콘드리아 네트워크의 리모델링과 미토콘드리아 유래 소포의 생성을 유도하여 세포질 내 mtDNA의 방출과 그에 따른 선천적 면역 반응의 활성화를 가능하게 한다는 것을 보여줍니다.

푸마르산염에서 말산염으로의 가역적 전환을 촉매하는 트리카르복실산(TCA) 주기의 대사 효소인 푸마르산염 수화효소(FH)는 진정한 종양 억제 인자로 확인되었습니다2. FH의 손실은 공격적인 형태의 신장암을 특징으로 하는 증후군인 유전성 평활근종증 및 신장 세포 암종(HLRCC)에 걸리기 쉽습니다. FH 결핍 세포와 종양 모두의 특징은 일련의 발암성 연쇄반응의 활성화를 통해 악성 변형과 종양 진행을 유도하는 것으로 밝혀진 푸마르산염의 비정상적인 축적입니다2. 그러나 종양이나 다른 세포 모델에서 분석할 때 이러한 신호 전달 계통은 모두 이미 동시에 활성화되어 서로 얽혀 있을 가능성이 높기 때문에 계층 구조, 누화 및 질병에 대한 인과적 기여를 밝히기가 어렵습니다.

여기에서 우리는 성인 신장에서 인간 FH의 마우스 상동체인 Fh1의 손실 연대기를 조사하기 위해 유도 가능한 형질전환 마우스 모델을 생성했습니다. 이전에 생성된 Fh1fl/fl 균주4를 Rosa26 유전자좌5에서 편재적으로 발현되는 타목시펜 유도성 Cre 재조합효소를 포함하는 마우스와 교배함으로써 우리는 타목시펜 유도성 Fh1fl/fl 균주를 얻었습니다(그림 1a). Fh1fl/fl 마우스를 타목시펜으로 처리하면 대조 균주(Fh1+/+)와 비교하여 Fh1 엑손 3 및 4(이하 Fh1-/-라고 함)가 효율적으로 제거되었습니다(그림 1b 및 확장 데이터 그림 1a,b). . FH의 손실은 아르기니노석신산염6의 비정상적인 세포내 축적과 푸마르산염이 유리 시스테인의 티올 그룹과 단백질의 티올기에 추가되어 S-(2-숙시닐)시스테인을 생성하는 반응 생성물을 포함하여 심오한 대사 변화를 일으킵니다. (2SC) 및 석신화 단백질. 두 반응 모두 과도한 푸마르산염 생산을 완충하는데, 이는 결국 이러한 완충 시스템과 다른 완충 시스템이 용량에 도달했을 때 발생합니다(확장 데이터 그림 1c). 우리는 Fh1-/-신장에서 5일째에 2SC의 초기 증가를 관찰한 후 10일째에 푸마르산염을 포함한 모든 대사 지표의 증가를 관찰했습니다(그림 1c). 거시적으로 야생형 신장과 Fh1 결핍 신장 사이에는 총 형태학적 차이가 없었습니다(그림 1d).

a, 유도 가능한 Fh1 녹아웃 대립유전자를 생성하기 위한 게놈 편집 전략. Rosa26-Cre-ERT2 마우스는 Rosa26 프로모터 하류에 타목시펜 반응성 Cre 재조합효소 이식유전자를 가지고 있습니다5. Fh1fl/fl 생쥐13은 Fh1 엑손 3과 4 옆에 2개의 loxP 부위를 포함하고 있습니다. 성체 생쥐에 타목시펜을 복강 내 주사하면 편재적으로 발현되는 Cre-ERT2 융합 단백질의 핵 전위가 유도되어 loxP 부위 사이에 위치한 게놈 조각이 절단됩니다. Fh1 널 대립유전자(Fh1−/−)를 생성합니다. 약 90일령의 마우스를 타목시펜으로 처리하고, 주사 후 5일 및 10일에 분석을 위해 신장을 수집합니다. b, qRT-PCR로 측정한 야생형 대조군(Fh1+/+) 및 Fh1 결핍(Fh1-/-) 성체 마우스 신장의 Fh1 mRNA 발현 수준. c, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)으로 측정한 Fh1+/+ 및 Fh1-/- 성체 마우스 신장의 대사물질 풍부도(정규화된 피크 이온 강도, 임의 단위(AU)). d, 유도 후 10일째 Fh1+/+ 및 Fh1-/- 성체 마우스 신장의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색. 스케일 바, 100μm. e, 유도 후 10일째에 Fh1-/- 대 Fh1+/+ 신장 조직의 차별적으로 조절되는 경로를 강조하는 GSEA의 화산 도표. FDR, 허위 발견률; NES, 정규화된 농축 점수. f, 유도 후 5일과 10일에 Fh1-/- 대 Fh1+/+ 신장 조직에서 상향 조절된 염증 관련 유전자를 보여주는 히트 맵(백혈구는 두 그룹 간에 차이가 없음을 의미함). g, qRT-PCR로 측정한 유도 후 5일 및 10일에 Fh1-/- 대 Fh1+/+ 신장 조직의 ISG 발현 수준. 데이터는 평균 ± sem b,c,g, n = 각 그룹의 최소 8마리의 마우스이며, Holm-Sidak 방법과의 다중 비교를 위해 Student's t-test가 수정되었습니다.