PI3K는 비타민 B5에서 조효소 A의 새로운 합성을 촉진합니다.

Nature 608권, 192~198페이지(2022)이 기사 인용

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호르몬과 성장 인자에 반응하여 클래스 I 포스포이노시티드-3-키나제(PI3K) 신호 전달 네트워크는 신진대사와 성장의 주요 조절자 역할을 하며 세포 영양 섭취, 에너지 생성, 보조 인자 생산 감소 및 거대분자 생합성을 조절합니다1. 수용체 티로신 키나제인 Ras, PTEN 및 PI3K를 포함하여 재발률이 가장 높은 암에서 많은 운전자 돌연변이는 PI3K 신호 전달을 병리학적으로 활성화합니다2,3. 그러나 PI3K에 의해 제어되는 핵심 대사 프로그램에 대한 우리의 이해는 거의 불완전합니다. 여기서는 질량 분석 기반 대사체학 및 동위원소 추적을 사용하여 PI3K 신호 전달이 가장 중추적인 대사 보조 인자 중 하나인 조효소 A(CoA)의 새로운 합성을 자극한다는 것을 보여줍니다. CoA는 세포 내 활성화된 아실기의 주요 운반체이며4,5 시스테인, ATP 및 필수 영양소 비타민 B5(판토테네이트라고도 함)6,7로부터 합성됩니다. 우리는 PI3K 이펙터 키나아제 AKT8의 기질로 판토테네이트 키나아제 2(PANK2)와 PANK4를 식별합니다. PANK2는 CoA 합성의 속도 결정 첫 번째 단계를 촉매하는 것으로 알려져 있지만 최소한으로 특성화되었지만 고도로 보존된 PANK49는 대사산물 포스파타제 활성을 통해 CoA 합성의 속도 제한 억제제라는 것을 발견했습니다. AKT에 의한 PANK4의 인산화는 이러한 억제를 완화시킵니다. 궁극적으로 PI3K-PANK4 축은 지질 대사 및 증식과 같은 아세틸-CoA 및 기타 아실-CoA, CoA 의존 과정의 풍부함을 조절합니다. 우리는 이러한 규제 메커니즘이 호르몬/성장 인자 중심 또는 종양 유전자 중심의 대사 및 성장 요구에 맞춰 세포 CoA 공급을 조정할 것을 제안합니다.

클래스 I PI3K 기반 대사 프로그램의 핵심 구성 요소를 검색하기 위해 우리는 비형질전환 인간 유방 상피 세포주 MCF10A를 사용하여 표지되지 않은 표적 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석기(LC-MS/MS) 기반 대사체학 스크린을 수행했습니다. . PI3K는 유선 성장에 중요한 역할을 하며 유방암의 주요 원인입니다10,11. MCF10A 세포는 성장과 증식을 위해 성장 인자 자극 PI3K 신호 전달에 유사하게 의존합니다. PI3K 억제제의 존재 또는 부재하에 PI3K 신호 전달을 급격하게 자극하기 위해 세포를 인슐린으로 처리했습니다 (확장 데이터 그림 1a). 알려진 PI3K 조절 대사 경로1의 변화를 유도하는 것 외에도 우리는 PI3K 억제가 비타민 B5(VB5)라고도 알려진 필수 영양소인 판토테네이트의 농도를 증가시키는 것을 관찰했습니다. VB5는 보조 인자 CoA6,7의 새로운 생합성을 위해 시스테인 및 ATP와 함께 독특하게 사용됩니다(그림 1a). 세포 내 활성화된 아실기의 주요 운반체로서 CoA는 영양소 이화작용 및 지질 합성을 포함한 다양한 핵심 대사 과정에서 중요한 역할을 합니다4,5.

a, CoA de novo 합성 경로. b, 동시 13C315N1-VB5 표지(3시간)를 사용한 인슐린(100nM) 및 PI3K 억제제(GDC-0941 또는 GDC-0032; 2μM) 처리, 이어서 혈청/성장 인자 결핍(18시간) 및 억제제 전처리(15 최소) MCF10A 세포에서. c, PI3K 억제제(GDC-0941; 2μM) 처리를 통한 PIK3CA+/+ 및 PIK3CAp.H1047R/+-노킹 MCF10A 세포. 라벨링 및 조건은 b에 설명된 것과 다릅니다. d, 4시간 처리 및 라벨링을 제외하고 b에 설명된 세포 및 조건을 갖춘 산 추출 CoA 및 단쇄 아실-CoA. e, b에 설명된 것과 달리 세포 및 조건을 사용하여 방사성 14C-VB5 표지(3시간)를 수행한 후 VB5가 없는 배지에서 추적(1시간)합니다. 분당 분해(DPM)는 단백질로 표준화되었습니다. f, 독시사이클린(Dox)-유도성 HA-태그된 야생형(WT)을 발현하는 MCF10A 세포의 동시 13C315N1-VB5 표지(3h)를 이용한 AKT 억제제(GDC-0068, 2μM) 및 mTORC1 억제제(라파마이신, 100nM) 처리 ) 또는 구성적으로 활성인(E17K) AKT. 치료 및 라벨링은 독시사이클린 배양(48시간), 혈청 및 성장 인자 박탈(18시간) 및 억제제 전처리(15분)가 선행되었습니다. g, 세포를 이용한 AKT 억제제(GDC-0068, 2μM) 및 ACLY 억제제(NDI-091143, 15μM) 처리, 표지 및 f에 기술된 것과 다른 조건. b-d, f 및 g의 경우 대사 산물은 LC-MS/MS를 사용하여 측정하고 단백질로 표준화했습니다. 표지된 대사산물(질량 + 4[M + 4]); 분수 풍부도는 [M + 4]/전체입니다. 백분율 변화 그래프의 경우 가장 왼쪽의 치료 그룹 평균을 0%로 설정했습니다. b–g의 경우 n = 3개의 생물학적 복제물(원)입니다. 데이터는 평균 ± sem입니다. Tukey 테스트를 통한 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. 별표(*)는 단검(†)으로 표시된 치료군 또는 괄호로 표시된 치료군(P < 0.05)과 비교하여 유의미한 차이를 나타냅니다. 전체 단백질과 인산화된(p) 단백질에 대해 조사된 면역블롯팅 분석.

25%) were tested for correlation to CoA levels as described above (PatternHunter, MetaboAnalyst 4.0; pattern: 3–2–1–2 for cell lines empty vector–PANK-WT–PANK4T406A–PANK4T406E; false-discovery rate < 0.1). Significantly correlated lipids with even-chain fatty acids were visualized by heat map as the average fold change relative to the row mean of each lipid./p> 20%) were visualized by heat map as the fold change relative to the average of the vector samples./p>

25%) that correlated with CoA levels between cell lines (Patternhunter, Metaboanalyst 4.0, false discovery rate < 0.1) are represented by heatmap as fold change relative to the row mean for each respective lipid species. Lipid classes altered by PANK4 T406 phosphorylation status are represented in pie charts. Relative levels of triacylglycerols in PANK4-expressing cell lines are graphed separately as fold change relative to the mean of the three PANK4-expressing samples for each given triacylglycerol. Replicate samples (○). Mean (bars). SD (error bars); n = 39 triacylglycerol species. *significant difference from treatment marked (†), one-way ANOVA with Tukey's test, (pi, 13C6-glucose labelling (16 h) of PANK4 KO AKT p.E17K/+ MCF10A cells stably expressing empty vector or PANK4-WT, grown in serum-free media with serum replacement and growth factors, followed by mass spectrometry-based lipidomics analysis. Protein immunoblots probed with indicated antibodies (left); molecular weight markers in kD (right). Since M+3 and above lipid isotopologues were enriched in labelled over unlabelled samples, the lipids for which the total signal for M+3 and above isotopologues was significantly different between vector and PANK4-WT cell lines (n = 3 biological replicates, two-sided student's t-test, false discovery rate < 0.1, fold change > 20%) were represented by heatmap as fold change relative to the average of vector control samples. Total levels and fractional abundance ((sum of ≥M+3)/total) of significantly altered labelled lipid species are also shown by heatmap. Lipid classes colour- and letter-coded (A-H). j, Diagram of labelled 13C6-glucose tracing into metabolites that generate fatty acids, glycerol backbones, and phospholipid headgroups. Polar metabolites were measured by mass spectrometry from PANK4 KO AKT p.E17K/+ MCF10A cells expressing empty vector, PANK4-WT or PANK4-D623A, and grown in serum-free media with serum replacement and growth factors. Metabolites are colour-coded by significant increase (red), no change (blue), and decrease (green) in PANK4-WT-expressing cells relative to empty-vector-expressing cells. k, Immunoblots of acid-extracted histones from PANK4 KO AKT p.E17K/+ MCF10A cells stably expressing empty vector, PANK4-WT, or PANK4-D623A, and grown in serum-free media with serum replacement and growth factors. Probed with indicated antibodies (left); molecular weight markers (right). Band intensities were quantified using ImageJ and acetyl-histone abundance was normalized to total histone abundance. Relative normalized acetyl-histone quantities are shown below each acetyl-histone band with the vector group set to 1. Representative of two independent experiments./p>

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