Mo에 의한 생물학적 질소 고정의 정량화

Scientific Reports 12권, 기사 번호: 22011(2022) 이 기사 인용

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표준 몰리브덴과 상보적인 바나듐 및 철 전용 질소 분해 효소 이소형에 의한 생물학적 질소 고정(BNF)은 새로 고정된 질소의 주요 천연 공급원입니다. 지구 질소 순환에 대한 제어를 이해하려면 환경 BNF를 담당하는 이소형에 대한 지식이 필요합니다. 아세틸렌 환원 분석에서 에틸렌과 아세틸렌 사이의 탄소 안정 동위원소(13C/12C) 분별을 측정하는 동위원소 아세틸렌 감소 분석(ISARA)은 동형 특이적 BNF 플럭스를 정량화할 수 있는 몇 가지 방법 중 하나입니다. 환경적 BNF 활성도가 너무 낮아서 동위원소 분석을 위한 충분한 에틸렌을 생성할 수 없기 때문에 전통적인 ISARA를 적용하는 것은 어려운 일이었습니다. 여기에서는 에틸렌 사전 농축과 가스 크로마토그래피-연소-동위원소 비율 질량 분석법(EPCon-GC-C-IRMS)의 인라인 결합을 통해 에틸렌 δ13C를 측정하는 고감도 방법을 설명합니다. 10% v/v 아세틸렌이 포함된 시료의 에틸렌 요구 사항은 > 500에서 ~ 20ppmv(사전 오프라인 아세틸렌 제거 시 ~ 2ppmv)로 감소됩니다. 교정 오류를 줄여 견고성을 높이기 위해 단일 질소 분해효소 동형 Azotobacter vinelandii 돌연변이와 환경 시료 분석은 에틸렌 생산을 위한 일반적인 아세틸렌 소스에 의존합니다. 저 BNF 활성 ISARA(LISARA) 방법을 저질소 고정 활성 토양, 낙엽, 부패한 나무, 암호 및 흰개미에 적용하면 대부분의 샘플 유형에서 보완적인 BNF가 나타나므로 동형 특이적 BNF에 대한 추가 연구가 필요합니다.

질소(N)는 근본적으로 생물학적 생산성의 한계를 설정하여 지구 환경 변화에 대한 자연 생태계의 반응을 제한할 가능성이 높습니다1,2,3. 대기 중 이질소(N2)를 암모니아로 전환하는 원핵생물 과정인 생물학적 질소 고정(BNF)은 새로운 생물학적 이용 가능한 질소를 글로벌 및 지역적 N 예산에 투입하는 주요 생물학적 투입물입니다. 따라서 이는 열대, 온대, 고위도 숲, 산지 풀과 관목뿐만 아니라 저서 및 외해 환경을 포함한 다양한 생태계에서 중요한 생지화학적 기능을 수행합니다4,5. BNF를 담당하는 금속효소인 질소효소는 활성 부위에 존재하는 전이금속을 특징으로 하는 3가지 주요 이소형으로 존재합니다: 정식 질소효소와 '대체', 또는 최근에는 '보완적' 바나듐(V) 단독과 철로 불립니다. Fe)-전용 질소 분해효소6,7. V 및 Fe 전용 질소 분해 효소는 Mo 독립적이며 Mo8 대신에 더 풍부한 지각 유래 미량 금속 V 및 Fe를 포함합니다.

환경 BNF에 대한 다양한 질소 분해 효소 이소형의 기여도를 결정하는 것은 생태계 BNF의 기계적 제어, 특히 다량 영양소와 생물학적 활성 미량 금속의 결합된 생지화학적 순환이 인위적 교란에 어떻게 반응하는지 이해하는 데 중요합니다. 전통적인 방법(즉, 아세틸렌 감소 분석 및 15N/14N 자연 존재비 방법)을 기반으로 한 BNF 비율 계산은 질소 분해 효소 이소형9,10,11에 민감하기 때문에 BNF에서 활성인 질소 분해 효소 이소형의 잘못된 귀속은 다음과 같이 N 예산 추정치를 변경할 수 있습니다. 최대 50%12,13 생태계 N 상태 및 관리에 영향을 미칩니다.

환경 BNF 플럭스의 금속 특이성은 이제 ISARA(Isotopic Acetylene Reduction Assay) 및 에탄 수율 방법과 질소 분해 효소 유전자 서열 분석을 통해 이소형 특이적 플럭스 추적을 적용하여 평가할 수 있습니다6,12,13,14. 이러한 접근법은 온대 에버글레이드 맹그로브 잎 쓰레기, 온대 해안 소금 습지 퇴적물 및 아한대 시아놀리첸에 이르는 다양한 샘플에서 비근근 BNF에 대한 보완적인 V- 및 Fe-전용 질소 분해 효소의 중요한 기여를 확인했습니다. 가장 최근에, 600km 북방림 영양 구배에 걸친 시아노리헨 BNF에 대한 연구는 Mo 제한 조건에서 BNF 입력을 유지하는 V-질소효소의 역할에 대한 최초의 생태계 규모 증거를 제공했으며13, "백업"에 대한 오랫동안 유지된 가설을 검증했습니다. 원래 실험실 연구에서 제안된 보완적인 질소 분해 효소의 역할. 또한 온대 토양9, 아한대 이끼11,18 및 부패하는 목재19에서 보완적인 BNF를 암시하는 낮은 아세틸렌 대 질소 환원 활성 비율(즉, R 비율)이 관찰되었습니다. 또한, 나무 뿌리 덮개, 흰개미 뒷장, 토양, 이끼 및 시아놀리헨에서 상보적이고 특성화되지 않은 질소 분해 효소 유전자가 발견되었습니다. 아한대18,25,26, 온대 및 열대림 생물군27,28,29,30,31,32,33에서 축적된 Mo 제한 BNF의 예와 함께 이러한 연구는 Mo 독립적이고 보완적인 BNF가 세계적인 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 그럼에도 불구하고 BNF 활성이 낮은 환경 샘플에서 Mo 독립적인 BNF 비율을 정량화하는 것은 보완적인 BNF 속성을 위한 가장 신뢰할 수 있는 방법인 ISARA12가 일반적으로 관찰되는 것보다 훨씬 더 높은 에틸렌 수율을 요구하기 때문에 어려운 일이었습니다(예: 토양, 이끼). , 나뭇잎 쓰레기는 일반적으로 1~2일 아세틸렌 감소 분석 인큐베이션 동안 < 300ppmv 에틸렌을 생성합니다. 중요한 생태계 내에서 보완적인 BNF와 그 제어에 대한 광범위한 연구에는 ISARA의 방법론적 개선이 필요합니다.

500 ppmv). Secondly, acetylene measurements (δ13Cacetylene) often have large uncertainties due to peak tailing and memory effects, which necessitates frequent GC column conditioning (i.e., a brief increase of temperature to remove water, acetylene, and any other analytes accumulated on the column) and combustion reactor oxidations in which pure O2 is flushed into the reactor at high temperature to regenerate the reactor's oxidative capacity. Finally, ethylene and acetylene isotope measurements are calibrated to the VPDB international carbon isotope reference scale using methane isotope standards because no ethylene standards with NIST traceable δ13C values exist. Deviations in chemical behavior between the methane standard and target analytes, ethylene and acetylene, during chromatographic separation and combustion can lead to biases during drift correction along and across multiple sample runs comprised of replicate measurements. The classical ISARA method is thus relatively time-consuming and limited to samples with high BNF activity./p> 500 ppmv) in 10% v/v acetylene were manually injected into a Thermo Scientific Trace GC Ultra-Isolink with an Agilent HP-PLOT/Q capillary GC column (30 m, i.d. = 0.32 mm, f.t. = 20 μm) and a combustion reactor connected to a Thermo Scientific Delta V Plus isotope ratio mass spectrometer (GC-C-IRMS; Fig. 1a). Modifications include the replacement of silver ferrules in the GC oven with Valcon polymide (graphite reinforced polymer) ferrules to limit memory effects from acetylene. The combustion reactor was oxidized with pure oxygen for 1 h before each run and brief (15 min) seed oxidations were performed between measurement batches (i.e., required every ~ 6–8 ethylene injections, ~ 4–6 acetylene injections) to regenerate reactor oxidation capacity and minimize drift of δ13C values. See Supplementary Table S1a online for additional instrument settings./p> 5000 ppmv (i.e., 5% of acetylene concentration), δ13Cethylene was also corrected for Rayleigh fractionation12,43./p> 100% (i.e., 100% FeNase is equivalent to ~ 140% VNase; Supplementary Table S4). Estimated uncertainty on the %FeNase scale is at most ~ 20%./p>

23.6 nmol C. The larger volume allowance of the EPCon autosampler (20 mL) relative to the GC-C-IRMS sample inlet port (≤ 1 mL) and increased sensitivity enables measurement of gases with ≥ 0.7 ppmv ethylene in the absence of background acetylene. The minimum ethylene concentration for samples with a background of 10% v/v acetylene (typical ARA samples) is 9 ppmv, or 2 ppmv if background acetylene is removed by chemical precipitation prior to EPCon analyses. Conservatively, minimum working ethylene concentrations for ARA samples are 500 ppmv (direct injection), 20 ppmv (EPCon-GC-C-IRMS), and 5 ppmv (chemical precipitation + EPCon-GC-C-IRMS). The lower sensitivity of the direct injection GC-C-IRMS method is partly due to the necessary use of a high split-ratio within the sample injector port (40:1 – the proportion of sample and He carrier gas flow that is vented from the injection port relative to the proportion that enters the GC column) to fully resolve ethylene (~ a few to several hundred ppmv) and acetylene (~ 100,000 ppmv) peaks with our capillary GC column./p> 5 V) apparent during δ13Cethylene analyses exacerbated peak tailing problems, causing decreased δ13Cethylene precision (by as much as 5‰). GC column and combustion reactor reconditioning was required when excess acetylene was inadvertently introduced into the GC-C-IRMS (e.g., incomplete venting within EPCon)./p> 160% in the %VNase scale and > 120% in the %FeNase scale must be strongly influenced by processes unrelated to BNF (e.g. natural endogenous ethylene cycling—production or consumption, gas leakage from stoppers). Non-BNF related fractionation may explain the > 160% VNase values observed for certain samples of litter (n = 1), moss (n = 1), soil (n = 4), decayed wood (n = 2)./p> 500 ppmv and the requirement for δ13Cacetylene measurements. Further, the offline precipitation step to completely remove acetylene from ARA sample headspace would enable any microbiology or wet-chemistry lab to outsource ISARA analyses of ethylene from sample and single nitrogenase calibration ARAs run with the same source acetylene to other stable isotope analytical laboratories for δ13Cethylene measurements. We note that the comparability of absolute δ13C values across research groups may vary and be difficult to assess as multiple factors (e.g., type of GC column and oxidation reactor state) can influence absolute δ13C values. This makes the simultaneous analyses of single nitrogenase calibration ARAs and environmental samples particularly important./p> 5% of the ARA produced ethylene concentration for a given sample type and location) in 12 out of 93 "no acetylene added" control samples. All 12 samples that contained endogenous ethylene were incubated for 290 to 300 h (27 samples were incubated for that long). Another batch of 27 samples incubated for 165 to 175 h did not show signs of endogenous ethylene production. Acetylene has been reported to inhibit ethylene oxidation, thus "no acetylene added" control samples might not be sufficient to assess endogenous ethylene production in ARAs with very low ethylene yield (< 20 ppmv)50. Thus, we recommend incubating samples for ideally less than 60 h when conducting an ISARA or LISARA surveys. Overall, the low endogenous ethylene production rate from our samples during incubations (Supplementary Table S3), and the similarity among isotopic signatures obtained for each sample type over four sites, 2 years, and various incubation times (2–300 h) indicates that natural ethylene cycling has minimal influence on our reported results./p>

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