바이러스

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 4101(2023) 이 기사 인용

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미오신 발현 및 정제는 정상적인 기능 및 돌연변이 유발 변화에 대한 기계적 통찰력을 얻는 데 중요합니다. 후자는 돌연변이가 여러 가지 쇠약성 질병을 일으키는 가로무늬근 미오신 II에 특히 중요합니다. 그러나 이 미오신의 중쇄는 발현하기가 어렵고 C2C12 세포를 사용하는 표준 프로토콜은 바이러스 감염에 의존합니다. 이는 시간과 작업 집약적이며 인프라 수요 및 생물학적 위험과 관련되어 광범위한 사용을 제한하고 광범위한 돌연변이의 빠른 생성을 방해합니다. 우리는 이러한 문제를 극복하기 위해 바이러스 없는 방법을 개발합니다. 우리는 이 시스템을 사용하여 인간 심장 미오신 중쇄의 운동 도메인으로 C2C12 세포를 형질감염시켰습니다. 세포 형질감염, 배양 및 수확 조건을 최적화한 후, 우리는 쥐의 필수 및 조절 경쇄와 함께 공동 정제된 발현된 단백질을 기능적으로 특성화했습니다. 시험관 내 운동성 분석에서 글라이딩 속도(1.5–1.7 µm/s; 25 °C)와 최대 액틴 활성화 촉매 활성(kcat; 8–9 s−1) 및 절반 최대 활성에 대한 액틴 농도(KATPase; 70) –80 µM)은 이전에 바이러스 기반 감염을 사용하여 발견된 것과 유사했습니다. 결과를 통해 새로운 유형의 연구(예: 추가 특성 분석을 위해 선택할 수 있는 광범위한 돌연변이 스크리닝)가 가능해야 합니다.

미오신은 ATP 회전율에 의해 구동되는 순환 과정에서 액틴 필라멘트와 상호 작용하여 힘과 운동을 발생시키는 분자 모터입니다. 이 과정은 근육 수축, 비근육 세포 운동성/힘 발달, 세포 내 화물 수송 및 세포 신호 전달과 같은 다양한 중요한 기능의 기초입니다1. 최근 미오신 슈퍼패밀리에서 최대 79개 클래스2가 확인되었습니다. 이들 모두는 액틴 결합 부위, 촉매 ATPase 부위 및 운동 기능뿐만 아니라 필라멘트 형성 및 화물 결합에 중요한 기타 요소가 있는 미오신 중쇄(MHC; ~ 90-250 kD)를 중심으로 구성됩니다. 또한, 안정화, 조절 및 조절 역할을 하는 경쇄가 각 중쇄에 부착됩니다. 미오신 운동 기능의 기본 메커니즘에 대한 통찰력뿐만 아니라 질병을 유발하는 돌연변이에 대한 자세한 연구를 위해서는 언급된 모든 단백질 구성 요소를 표현하고 정제할 수 있는 것이 중요합니다.

단백질 발현 및 정제에 가장 많이 사용되는 시스템은 E. coli를 발현 숙주로 사용하여 높은 정제 수율(발현 산물이 용해성인 경우)은 물론 노동력 및 비용 효율성도 높입니다3. 그러나 원핵생물 시스템에는 진핵생물 단백질의 적절한 접힘 및 번역 후 변형을 지원하는 완전한 세포 기구가 부족합니다. E. coli를 사용하여 기능성 미오신 경쇄의 발현 및 정제가 가능한 반면, 미오신 중쇄(MHC)는 이 시스템을 사용하여 기능성 형태로 생산할 수 없습니다4. 따라서 Dictyostelium5,6,7, Drosophila melanogaster8, 곤충 세포9,10,11,12,13,14 및 포유류 세포15,16를 기반으로 하는 다양한 진핵생물 발현 및 정제 시스템이 개발되었습니다. 이러한 시스템은 다양한 MHC 클래스의 생산에 잘 작동하지만 척추동물 가로무늬근 미오신17,18,19에서는 제한적인 성공을 거두었습니다. 아마도 근육 세포의 모든 단백질 접힘 기구를 포함하지 못했기 때문일 것입니다. 많은 논문에서 UNC-45가 미오신 접힘 및 근절 조립에 관여하는 샤페론으로 확인되었지만 Hsp70/Hsp9025 및 샤페로닌과 같은 다른 요인도 관련된 것으로 보입니다. 이러한 견해에 따라 Winkelmann과 동료들은 가로무늬 근육 미오신을 완전히 기능적인 형태로 적절하게 접는 것이 차별화된 근육과 유사한 환경, 즉 근육 근관27,28,29에서만 발생한다는 증거를 제시했습니다. 이 아이디어를 바탕으로 myotube로 분화되는 마우스 C2C12 myoblast가 선택된 발현 숙주 세포주로 도입되었습니다. 근모세포는 프로모터 아래 닭 배아 골격근 MHC를 운반하는 플라스미드로 형질감염되었으며, 이는 MHC 발현이 근관으로의 분화 시에만 시작되도록 보장합니다. 정제 수율은 액틴 활성화 ATPase 활성을 기반으로 미오신 기능을 평가하기에 충분했습니다. C2C12 기반 발현 및 정제 시스템(여기서는 "C2C12 기반 시스템")의 초기 버전에서 안정적인 세포주27를 생성하면 형질감염 주기를 제거하는 시간과 비용 효율적인 작업 흐름으로 상대적으로 높은 정제 수율을 제공합니다. 그러나 안정적인 세포주 개발에는 최대 12개월이 필요할 수 있으며30 특정 미오신의 여러 가지 다른 구성(예: 점 돌연변이)을 검사하는 데 가장 적합한 접근 방식은 아닙니다. 대조적으로, 일시적 표현은 짧은 개발 시간과 빠른 회전율의 장점을 제공합니다. 따라서 C2C12 기반 시스템은 나중에 비대성 심근병증과 관련된 미오신 점 돌연변이의 영향을 소개하고 연구하기 위해 일시적인 아데노바이러스 발현을 활용하여 수정되었습니다. 동일한 시스템은 Resnicow et al.32에 의해 추가로 최적화되어 재조합 인간 골격 및 심장 미오신 이소형33,34,35의 일시적 동역학 분석을 위한 충분한 양의 MHC를 생산할 수 있습니다. 주목할 점은 인간 β-심장 미오신 돌연변이가 곤충 세포에서 발현되고 정제된 이전 보고서보다 이 연구에서 야생형(WT)과 돌연변이 β-심장 미오신 모두에 대해 상당히 높은 ATPase 활성이 달성되었다는 것입니다. 현재, C2C12 근관의 아데노바이러스 기반 감염은 무엇보다도 중요한 기능적 연구, 시험관 내 운동성 분석 및 일시적 생화학 용액 역학34,36을 위해 적절하게 접혀 있고 기능적인 줄무늬 근육 미오신(S1 및 HMM 유사 구조)의 충분한 양을 생산할 수 있습니다.

3 µm./p> 3 µm (Fig. 3E, F), suggests that the density is sufficient for attainment of maximum sliding velocity which would then be limited by the cross-bridge detachment rate constant (as in muscle) without effects of the attachment rate61,62. A consideration in interpreting the results in Fig. 3E, F is that the velocity is known to saturate for sufficiently long filaments also at low myosin densities but at a lower value61. However, we are nevertheless confident that the motor density is sufficiently high in our study to motivate the conclusion that the velocity is detachment limited. First, the saturation occurred already at filament lengths of about 3 µm rather than at longer lengths found at low motor densities in the study of Uyeda et al.61. Moreover, as further evidence for a motor density sufficient to give detachment limited velocity, the maximum velocities observed in our study are similar to those found in previous work using adenovirus-based protein production (Table S1 and Fig. S4) and also consistent with those found in muscle cells63./p>

A vial of the mouse myogenic C2C12 cell line (ATCC CRL 1772) was purchased from Sigma (Sigma-Aldrich, Germany, now Merck). The cell line has been derived by serial passage of primary cultures of adult thigh muscle after injury85. For routine culture, C2C12 cells were seeded at a density of 103 cells/cm2 (for 3 days growth) or 0.5 × 103 cells/cm2 (for 4 days growth). They were then grown in growth medium, GM [DMEM-high glucose no sodium pyruvate (Sartorius, Germany), 10% Fetal Bovine Serum (HyClone), 1% Antibiotic–Antimycotic solution (Gibco) and 2 mM L-glutamine (Sigma)] in polystyrene cell culture flasks or dishes (Sarstedt) at 37 °C in a humidified condition supplied with 5% CO2 (Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubator, Thermo Fisher). The cells were subcultured when the confluency was around 60–70%. Under our cell culture conditions, doubling time was estimated (2006)." href="/articles/s41598-023-30576-1#ref-CR86" id="ref-link-section-d92737242e1505"86 to be 16 ± 2 h (mean ± SD, n = 43)./p>

(2006)./p>

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