T 세포의 RASA2 절제로 항원 민감도가 향상되고 수명이 길어집니다.

Nature 609권, 174~182페이지(2022)이 기사 인용

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암 치료를 위한 입양 T 세포 치료법의 효능은 외인성 요인과 내인성 억제 체크포인트의 억제 신호에 의해 제한될 수 있습니다1,2. 표적 유전자 편집은 이러한 한계를 극복하고 T 세포 치료 기능을 향상시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다3,4,5,6,7,8,9,10. 여기에서 우리는 T 세포 기능 장애를 예방하기 위해 표적으로 삼을 수 있는 유전자를 식별하기 위해 다양한 면역 억제 조건에서 여러 게놈 전체 CRISPR 녹아웃 스크린을 수행했습니다. 이 스크린은 인간 T 세포의 신호 체크포인트로 식별되는 RAS GTPase 활성화 단백질(RasGAP)인 RASA2에 수렴되었으며, 이는 급성 T 세포 수용체 자극 시 하향 조절되고 만성 항원 노출에 따라 점차 증가할 수 있습니다. RASA2 절제는 표적 항원에 반응하여 MAPK 신호 전달 및 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 세포용해 활성을 강화했습니다. 시험관 내에서 반복된 종양 항원 자극은 RASA2가 결핍된 T 세포가 대조군 세포에 비해 증가된 활성화, 사이토카인 생산 및 대사 활성을 나타내며 지속적인 암세포 사멸에 현저한 이점을 나타내는 것으로 나타났습니다. RASA2가 녹아웃된 CAR T 세포는 백혈병 마우스 모델에서 골수의 대조 세포에 비해 경쟁력 있는 적합도 이점을 보였습니다. T 세포 수용체의 여러 전임상 모델과 CAR T 세포 치료법에서 RASA2를 제거하면 액체 또는 고형 종양이 이식된 생쥐의 생존 기간이 연장되었습니다. 함께, 우리의 연구 결과는 RASA2가 암 치료를 위한 T 세포 치료법의 지속성과 효과기 기능을 모두 향상시킬 수 있는 유망한 표적으로 강조합니다.

CAR T 세포는 공격적인 혈액학적 악성 종양의 하위 집합에서 변형되었으며, T 세포 수용체(TCR)-형질전환 T 세포(TCR T 세포)는 고형 종양에 대한 초기 단계 임상 연구에서 유망한 결과를 보여주었습니다1. 그러나 많은 암, 특히 고형 종양은 현재의 T 세포 치료법에 반응하지 않거나 초기 반응 후 빠르게 진행됩니다. 종양 덩어리 내에서 면역억제성 미세환경은 항종양 면역의 효능에 실질적인 장벽이 됩니다2,11. 또한, 항원에 지속적으로 노출되면 T 세포 기능 장애가 발생할 수 있으므로 조작된 T 세포에서 이펙터 기능과 장기간 지속성의 균형을 맞춰야 할 필요성이 강조됩니다3,12. 선별된 유전자의 표적 조작은 입양 T 세포 치료법의 효능을 높이기 위한 전략으로 테스트되고 있습니다5,6,7. 그러나 인간 T 세포의 최적 유전자 표적은 체계적으로 탐색되지 않았습니다. 대규모 CRISPR 스크린은 조작된 T 세포의 효능을 높일 수 있는 유전적 교란의 발견을 가속화할 수 있습니다3,8,9,10. 우리는 이전에 일차 인간 T 세포에서 발견 플랫폼을 개발하고 이를 적용하여 T 세포 증식의 새로운 유전 조절자를 식별했습니다. 여기에서 우리는 T 세포가 여러 억제 단서를 극복하기 위한 전략으로 RASA2 유전자의 절제를 밝혀낸 종양 미세 환경(TME)에서 일반적으로 발생하는 여러 면역 억제 조건 하에서 수행되는 편견 없는 유전 스크린을 설명합니다. 우리는 RASA2의 절제가 항원에 대한 민감성을 향상시키고 CAR T 및 TCR T 세포의 효과기 기능과 지속성을 모두 향상시키는 것을 발견했습니다. 마지막으로, 우리는 항원 특이적 T 세포의 RASA2 절제가 액체 및 고형 종양의 여러 전임상 모델에서 종양 제어를 강화하고 생존 기간을 연장할 수 있음을 보여줍니다.

억제성 TME 및 T 세포 내재 체크포인트는 고형 종양을 표적으로 하는 조작된 T 세포의 효능에 영향을 미칠 수 있습니다14. 우리는 TME에서 발생하는 다양한 억제 신호에 T 세포가 저항하도록 만들 수 있는 유전적 교란을 식별하기 위한 체계적인 접근 방식을 개발했습니다. 우리는 이전에 저산소 TME15에서 높은 수준의 아데노신에 반응하여 상승된 아데노신 A2A 억제 신호 전달을 시뮬레이션하기 위해 아데노신 작용제인 CGS-21680을 사용했습니다. 여기서 우리는 TME의 T 세포 기능에 대한 여러 가지 문제를 모델링하기 위해 이 전략을 확장했습니다. 내인성 체크포인트 신호를 모델링하기 위해 우리는 종양 침윤 T 세포에서 자주 억제되는 T 세포 활성화의 중요한 경로인 칼슘 및 칼시뉴린 신호 전달 억제제(타크로리무스 및 사이클로스포린)에 중점을 두었습니다. TME에서 눈에 띄는 외부 억제 신호를 모방하기 위해 우리는 종양 내에서 T 세포 기능을 제한하는 표준 억제 사이토카인인 TGFβ를 사용했습니다. 마지막으로, T 조절 세포(Treg 세포)는 여러 종양 유형에서 T 세포 기능 장애의 중요한 중재자이기 때문에 우리는 스크리닝 플랫폼을 조정하여 세포-세포 상호 작용을 분석함으로써 Treg 세포에 의한 이펙터 T 세포 억제에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 밝혀냈습니다.

1.5) between 5 (blue) and all 6 (pink) of the screens are labelled. Bar height is the number of shared genes among the screens, connected by dots in the lower panel (n = 4 human donors for stimulated (stim) and Treg cell screens, n = 2 for adenosine, cyclosporine and tacrolimus, and n = 1 for the TGFβ screen). c,d, log2 fold change (FC) for individual guide RNAs (vertical lines); background shows the overall guide distribution in greyscale. c, Guides targeting RASA2 (pink) across all suppressive conditions. d, Guides targeting RasGAP family members other than RASA2 were not enriched consistently in either direction, whereas guides targeting the RasGEF RASGRP1 were depleted from dividing cells as expected. e, Distribution of CFSE staining in RASA2-KO versus control (Ctrl; non-targeting guide RNA) T cells across all suppressive conditions. f, Cancer cell growth during in vitro cancer cell-killing assay under suppressive conditions. AUC, area under the growth curve. n = 2 donors in triplicate, shape denotes donor. g, Suppression assay confirms that RASA2 ablation rendered T cells resistant to Treg cell suppression of proliferation in vitro. Bars show the CD8+ cell count 4 days after stimulation (n = 4 donors per group; mean ± s.e.m.; **P < 0.01 and ***P < 0.001, two-sided paired Student's t-test). h, RASA2 ablation rendered T cells resistant to Treg cell suppression compared with control T cells in an in vitro cancer cell-killing assay for one representative donor out of four (summary statistics shown in Extended Data Fig. 2g). Line is the mean and shaded area is 95% confidence interval for 3 technical replicates./p>

1.54) were defined as hits for the shared hits analysis to generate Fig. 1b and Extended Data Fig. 1c and are detailed in Supplementary Table 1. To define suppressive condition-specific hits, the sgRNA counts in CFSE-low (highly dividing) cells were compared to the stimulation only (stim) condition using MAGeCK software as above. Results of this analysis are provided in Supplementary Table 2. For the quality metric of screens by dropout analysis of essential genes, we used essential genes as determined by DepMap19 and GSEA for gene-level log2 fold change. For analysis of expression of screen hits in primary human T cells the DICE database was used, averaging the expression of both activated CD4+ and CD8+ T cells20./p>

1010 photons s–1 or when mice demonstrated signs of distress described in our IACUC protocol such as respiratory distress, hunched posture, lesions unresponsive to treatment, 15–20% weight loss, impaired or decreased mobility, neurologic signs that interfere with normal function or reduced grooming. These limits were not exceeded in any of the experiments. Mice were injected intraperitoneally with 1 × 106 LM7-GFP-ffluc osteosarcoma tumour cells. Seven days later, mice were injected intraperitoneally with 1 × 105 CAR T cells. The experiment was performed twice with CAR T cells generated from two different healthy donors. For the second experiment, mice that had long-term tumour-free survival (n = 1 for control KO, n = 3 for RASA2 KO) were re-challenged with an intraperitoneal injection of 1 × 106 LM7-GFP-ffluc tumor cells at day 174. Tumour burden was monitored by bioluminescence imaging as above./p>

1.5, methods) across the screen conditions (x-axis) including hits unique to each individual screen. Shared hits for each subset are detailed in Supplementary Table 1. d, Heatmap of the pairwise Pearson's correlation coefficient for gene-level z-scores for all screen conditions. e, Volcano plots showing p-value (MAGeCK RRA one-sided test and methods) on the y-axis and gene-level z-scores on the x-axis, comparing highly dividing cells in each suppressive condition to highly dividing in the vehicle condition. Highlighted are genes found to be specific to adenosine and TGFβ screens, selected for further validation. f, Gene targets from screens were selected as either general (PAN) or more specific to certain suppressive contexts and were knocked out individually in T cells. CFSE stained, Cas9 RNP-electroporated edited T cells were stimulated and cultured in the different suppressive conditions. Percent of cells proliferating for each gene KO compared to control cells are displayed for each suppressive condition (n = 2 donors, 2 sgRNAs per gene target in triplicates. We highlighted gene KOs found to confer significant resistance in predicted conditions (adenosine, TGFB, and calcium/calcineurin inhibitors – Tacrolimus, and Cyclosporine), using a cut-off of FDR adjusted p-value < 0.05. For clarity, displayed are the significant p-values for gene targets according to their suppressive screen condition of origin, but results for all genes across conditions are detailed in Supplementary Table 3). As expected, ADORA2A, TGFBR1 and TGFBR2, FKBP1A, and PPIA KOs conferred resistance in the adenosine, TGFB, Tacrolimus, and Cyclosporine conditions, respectively. PDE4C and NKX2-6 KOs were found to confer relatively selective resistance in the adenosine condition, and NFKB2 KO was found to increase resistance in the calcineurin inhibitor (tacrolimus and cyclosporine) conditions. TMEM222, while scoring very highly in the screens, did not increase proliferative advantage in this arrayed validation (dots are individuals replicates, black vertical lines are the mean, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 and ***p < 0.0001 for two-sided unpaired Student's t-test). g, Log fold change (LFC) of guides targeting RasGAP genes or the RasGEF RASGRP1, across the different suppressive screen conditions shown here. h, Expression levels (scaled to minimum of 0 and a maximum of 1) of the RasGAP family members available in the BioGPS dataset27, including RASA2, across healthy human tissues revealed RASA2 as selectively expressed in CD8+/4+ human T cells. Data also shown for RASGRP1, a RasGEF with defined roles in TCR signaling and an expression pattern strikingly similar to that of RASA2./p>

1, as determined by DESeq2 analysis (methods). c, d Gene set enrichment analysis (GSEA) of oxidative phosphorylation (c) and glycolysis (d) ranked genes, based on DESeq2, higher rank indicates enrichment in RASA2 KO over CTRL. p-value is shown as determined by a two-sided permutation-test. Top up-regulated genes in each enrichment are listed to the right of each panel e, GSEA of oxidative phosphorylation genes correlated with RASA2 expression in immune cells in the GEO expression database, as retrieved by correlationAnalyzeR (methods). Genes are ranked by the Pearson correlation coefficients between RASA2 and the query gene, p-value by two-sided permutation test, after FDR adjustment. f, Selected examples of expression of RASA2 and two mitochondrial fitness genes, MRPL27 (left panel) and MRPL14 (right panel) across GEO datasets from immune cells. Shown at the top is the Pearson's correlation coefficient (R) and FDR adjusted p-value (padj) for each scatter plot. Values represent expression after variance stabilizing transformation (VST). g, Expression of RASA2 in stimulated T cells compared to unstimulated T cells, as measured by published single-cell RNA-Seq dataset, for two human donors13. h, i, Expression of Rasa2 compared to Pdcd1 in published RNA-Seq datasets from models of T cell exhaustion in murine T cells. Expression was scaled for a maximum of 1 and a minimum of 0 for each gene in each dataset (For LCMV samples in (h): n = 2 mice for Naive group, n = 3 mice for exhaustion group; for OVA samples, error bars are mean ± SEM (i): n = 3 mice for all groups, error bars are mean ± SEM). j, Log fold change (LFC) values for RASA2 sgRNAs in CRISPRa and CRISPRi screens for cytokine production42 (MAGeCK's gene-level FDR listed for RASA2 in each screen). k, Western blot for level of RASA2 expression following RASA2 transgene or control (CTRL) transduction in two T cell donors. l, Normalized values for T cell expansion based on cell counts for T cells with RASA2 transgene versus GFP control (n = 3 human T cell donors, mean ± SEM, shape denotes donor). m, histogram for one example donor from cells described in (l), stained and FACS analyzed for CD69 activation marker. n, Summary data for CD69 levels in two T cell donors transduced with the RASA2 transgene versus control (n = 2 human T cell donors, shape denotes donor)./p>

0.05 for two-sided Wilcoxon test, shape denotes donor)./p>

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