곰팡이 리그노셀룰로오스의 동정

커뮤니케이션 생물학 5권, 기사 번호: 1254(2022) 이 기사 인용

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활동 기반 단백질 프로파일링(ABPP)은 지금까지 주로 생물의학에 적용되면서 다양한 생리학적 조건에서 효소 활성을 연구하기 위한 다목적 생화학적 방법으로 등장했습니다. 여기서 우리는 호열성 및 리그노셀룰로오스 분해 백색부패균인 Phanerochaete chrysosporium의 생체촉매 발견에서 ABPP의 잠재력을 보여줍니다. 목재 기질 결합 효소의 직접적인 프로파일링을 포함한 비교 ABPP 기반 기능적 스크린을 사용함으로써 우리는 리그노셀룰로오스 분해 탄수화물 에스테라제(CE1 및 CE15)와 글리코시드 가수분해효소(GH3, GH5, GH16, GH17, GH18, GH25, GH30, GH74 및 GH79) 효소는 기질 존재 시 특이적으로 활성을 나타냅니다. 곰팡이 효소의 발현이 여전히 어렵기 때문에 ABPP 매개 접근법은 가장 유망한 생체촉매에 실험적 노력을 집중하기 위한 사전 선택 절차를 나타냅니다. 또한, 이 접근법은 DUF(Domain-of-Unknown Function)의 기능적 주석을 허용할 수도 있습니다. 따라서 여기에 설명된 ABPP 기반 생체촉매 스크리닝은 관심 있는 과정에서 활성 효소를 식별하고 알려진 대응물과 서열 유사성을 공유하지 않는 새로운 생체촉매를 해명할 수 있습니다.

활동 기반 단백질 프로파일링(ABPP)은 기초 생물학 연구1,2,3,4,5에서 널리 사용되는 화학 단백질체학 방법론으로 등장했습니다. ABPP에서는 표적 단백질과 비가역적 공유 결합을 형성하고 종종 높은 효소 클래스 특이성을 보장하는 효소 억제 부분인 반응성 "탄두", 링커 및 리포터로 구성된 활동 기반 프로브(ABP)입니다. 태그는 기본 생리학적 조건에서 활성 효소에 대한 라벨링, 식별 및 보고에 사용됩니다. 리포터로는 비오틴, 형광단 또는 알킨이나 아지드 부분과 같은 소위 2단계 리포터 태그가 자주 사용됩니다. 지난 몇 년 동안 새로운 효소 계열을 표적으로 하는 새로운 ABP를 개발하고 무엇보다도 약물 발견(표적 및 리드 발견, 표적 참여)에서의 사용을 확립하기 위한 집중적인 노력이 이루어졌습니다.7,8,9,10,11 ,12, 식물 생물학13 또는 미생물학14,15,16,17,18.

진화하는 대체 ABPP 응용 프로그램은 생체촉매 스크리닝 및 생명공학에서의 사용입니다(여기서는 생체촉매를 잠재적인 산업적 용도가 있는 효소로 정의합니다)19,20,21. 예를 들어, ABPP는 리그노셀룰로오스와 같은 복잡한 고분자 바이오매스를 전환할 수 있는 미생물 생체촉매를 발견하는 데 사용될 수 있으며, 이는 지속 가능한 에너지 및 순환 생물경제 과정의 맥락에서 많이 추구되는 개체입니다22,23,24. 서열 상동성 기반 생체촉매 스크리닝 접근법(예: 유전체학 데이터 분석)과 달리, ABPP는 원칙적으로 서열 상동성을 할당할 필요 없이 바람직한 기질 선호도를 갖는 새로운 생체촉매를 식별하기 위해 ABP의 확립된 효소 선택성을 이용합니다. .1a)26,27. "ABP 기반 농축"이라고 하는 것에서는 활성이 있어 ABP와 반응할 수 있는 효소만 선택하여 LC-MS/MS 기반 시퀀싱을 통해 식별합니다. 이는 표적에 따라 단백질 식별을 제한합니다. 사용된 ABP의 특이성. 따라서 종종 번거로운 생화학적 단백질 발현 및 정제는 ABPP에 의해 미리 선택된 생체촉매로만 제한됩니다. 이는 체계적인 단백질 발현에 의존하는 스크리닝 방법과 비교할 때 작업이 엄청나게 감소합니다. 이는 특히 목재 분해 효소의 경우 복잡한 글리코실화 패턴의 결과로 인해 어려운 이종 단백질 발현 및 정제로 인해 종종 방해를 받는 곰팡이 생체촉매 스크린 캠페인과 관련이 있습니다. 이러한 본질적인 발전에도 불구하고, ABPP 기반 생체촉매 발견은 주로 모델 유기체의 순수 배양물, 그리고 더 중요하게는 성장을 위한 표준 배양 배지를 사용하는 개념 증명 연구에 적용되었습니다30,31,32,33,34 .

2 were considered significantly enriched and all proteins with a positive fold change were plotted against their numerical order. To examine the effect of the competitor pretreatment on protein enrichment, a two-sided Student's t-test (permutation-based FDR: 0.05, s = 0.1, 250 randomizations) was performed to calculate the difference in protein abundance between noncompetitive and pretreated probe-labeled samples and the statistical significance of the fold change. The log2-fold change for samples preincubated with the corresponding competitors compared to noncompetition samples labeled with the respective probe was plotted against the –log p value. Proteins with a reduction of >75% in their abundance and a p value < 0.01 were considered as primary hits, while proteins with a p value < 0.05 were reported as secondary hits. The protein ID was reported as either JGI ID or Uniprot ID./p>

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