Scientific Reports 13권, 기사 번호: 8778(2023) 이 기사 인용
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벡터 매개 사상 선충류 질병은 전 세계적으로 인간과 가축에게 심각한 질병 부담을 야기합니다. 포유류 숙주 반응의 기생충에 의한 면역 조절에 대한 강력한 직접적인 증거가 있지만 벡터 숙주의 기생충 면역 조절에 대한 증거는 적습니다. 우리는 이전에 사상충 선충이자 림프 사상충증의 원인 물질인 Brugia malayi의 모든 생활 단계가 세포외 소포(EV)를 분비한다고 보고했습니다. 여기서 우리는 벡터 호스트 Aedes aegypti에 대한 마이크로필라리아 유래 EV의 면역 조절 효과를 조사합니다. Ae의 RNA-seq 분석. B. malayi microfilariae EV로 처리된 aegypti 세포주는 mRNA와 miRNA 모두의 차별적인 발현을 보여주었습니다. AAEL002590, Ae. 세린 프로테아제를 코딩하는 aegypti 유전자는 세포가 시험관 내에서 생물학적으로 관련된 EV 농도로 처리될 때 하향 조절되는 것으로 나타났습니다. 생물학적으로 관련된 농도의 EV를 성체 암컷 모기에 주입하면 생체 내에서 이러한 결과가 검증되어 AAEL002590 전사체의 하향 조절이 요약됩니다. 이 유전자는 표준 멜라닌화 반응을 유도하는 모기 페놀옥시다제(PO) 캐스케이드에 관여할 것으로 예측되었으며 이에 따라 RNAi를 사용하여 이 유전자를 억제하고 기생충 EV 처리를 하면 생체 내에서 PO 활성이 감소했습니다. 우리의 데이터는 기생충 유래 EV가 멜라닌화를 포함하여 벡터 숙주의 중요한 면역 반응을 방해한다는 것을 나타냅니다.
벡터 매개 사상충 선충류 질병은 전 세계적으로 인간, 가축, 가축 및 야생동물에게 심각한 건강 부담을 야기합니다. 인간의 경우 림프 사상충증(LF)은 Brugia malayi를 포함한 여러 종의 사상충 선충에 의해 발생하며 72개국에서 풍토병으로 8억 6천만 명 이상이 감염되었거나 감염 위험에 처해 있습니다1. 성체 기생충은 림프 혈관계에 상주하며 비록 증상이 없는 경우가 많지만 감염은 림프관염, 림프부종(주로 사지) 및 이차 세균 감염/피부염을 비롯한 극심한 질병을 초래할 수 있습니다2. 현재의 통제 전략은 성체 기생충을 효과적으로 죽이지 못하거나 확립된 감염을 해결하지 못하는 부적절한 구충제를 사용하여 전염을 방해하는 대량 약물 투여 프로그램에 의존합니다. 사상충 선충 질병에 대한 새로운 제어 전략의 필요성은 분명하지만 기생충 생물학 및 숙주-기생충 상호 작용에 대한 이해의 격차로 인해 효과적인 치료법 개발의 진전이 지연되었습니다. 기생 사상충 선충은 생활사를 완료하기 위해 중간 벡터(모기) 숙주와 최종(포유류) 숙주가 모두 필요합니다. 두 숙주 모두에서 선충은 감염을 일으키고 확립하기 위해 숙주의 유도된 면역 반응을 피해야 합니다. 숙주 면역 반응 조작을 포함하여 다양한 면역 회피 전략이 문서화되었습니다3. 포유류에서는 이러한 기생충 유래 면역 조절에 대한 직접적인 증거가 있습니다. 기생충은 조절 면역 세포 집단을 확장할 수 있으며4,5,6,7,8,9,10, CD4+ Th1 세포에서 세포사멸을 유도하고11,12,13,14 기생충 감염을 인식하는 세포에서 패턴 인식 수용체(PRR) 신호를 조작할 수 있습니다15 ,16,17,18,19,20,21, IL-4 및 IL-1022,23,24를 포함한 조절 및 항염증 사이토카인의 일반적인 환경을 향상시킵니다.
벡터 숙주의 맥락에서 초기 연구는 사상 선충에 의한 멜라닌화 면역 반응의 잠재적인 면역 조절에 대한 증거를 제공했습니다. 모기 감염 기생충의 미세한 유충 단계에 대한 중요한 모기 선천적 면역 반응인 멜라닌 캡슐화는 선충의 성장과 번식을 방지하고 결국 사망에 이르게 하는 핵심 절지동물 방어 메커니즘입니다. 멜라닌성 캡슐화에는 모기의 선천적 면역 반응의 체액성 및 세포성 구성 요소가 모두 포함됩니다. 병원체를 인식하면 곤충 선천 면역의 세포 부문은 무척추 면역 효과 세포인 혈구의 응집을 유도하여 침입한 병원체 주위에 다세포 층을 형성합니다. 동시에, 곤충 선천 면역의 체액성 부분은 혈구에서 멜라닌 생성을 시작합니다30,31,32,33,34,35,36,37,38. 이 과정은 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)이 패턴 인식 수용체(PRR)에 결합하여 세린 프로테아제 캐스케이드를 유도할 때 시작되는 페놀옥시다제(PO) 캐스케이드에 의해 제어됩니다. 이 캐스케이드는 궁극적으로 프로페놀옥시다제 활성화 인자의 활성화로 이어지며, 이는 차례로 페놀옥시다제를 활성화시킵니다39,40,41. 페놀옥시다아제는 페놀을 퀴논으로 산화시켜 멜라닌을 생성할 수 있습니다29. 기생충의 사망은 영양 결핍, 질식 또는 멜라닌 생성 중에 생성되는 퀴논 및 기타 활성 산소종과 같은 독소 생성을 통해 발생하는 것으로 여겨집니다42,43. 모기 Aedes aegypti에서는 사상충 감염에 대한 이러한 멜라닌화 경로가 감소되어 기생충이 이 중요한 반응을 조작했음을 시사합니다25,27,44. 모기 면역 반응의 기생충에 의한 조절 패러다임을 뒷받침하는 기생충 침입에 대한 반응으로 벡터 숙주 전체 전사체 변화를 탐구하는 최근 연구는 감염 중 면역 관련 유전자의 하향 조절을 확인했습니다45,46,47,48,49,50.
1or log2(fold change) < −1), this up- and down-regulation was only statistically significant (p < 0.05) for a small cohort of genes. Interestingly, while evaluating genes within our fold change threshold, but outside of the statistically significant threshold, we identified that this expanded pool of differentially regulated genes was enriched in transcripts encoding proteins that are strong candidates for immunomodulation, including a cohort of proteases with potential involvement in the melanization pathway (Table 2). The full list of differentially expressed genes can be found in Supplemental Materials 2./p> 7.0. Small RNA libraries were prepared using 1 µg of total RNA and the TruSeq Small RNA Sample Prep Kits (Illumina) according to manufacturer's instructions. Single-end sequencing was performed on an Illumina Hiseq 2500 (Illumina) according to manufacturer's instructions. Raw reads were subjected to an in-house program, ACGT101-miR (LC Sciences), to remove adapter dimers and junk, low complexity and common non-target RNA families (rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA) and repeats. Remaining unique sequences with length 18–26 nucleotides were mapped to specific species precursors in miRBase 22.091,92,93,94,95,96 and by BLAST search97 to identify known miRNAs and novel 3p- and 5p- derived miRNAs with their genomic location. Length variation at both 3′ and 5′ ends and one mismatch inside of the sequence were allowed in the alignment. The unique sequences mapping to specific species mature miRNAs in hairpin arms were identified as known miRNAs. The unique sequences mapping to the other arm of known specific species precursor hairpin opposite to the annotated mature miRNA-containing arm were considered to be novel 5p- or 3p derived miRNA candidates. Hairpin RNA structures of unmapped sequences were predicted from the flanking 80 nucleotide sequences using RNAfold98. The criteria for secondary structure prediction included number of nucleotides in one bulge in stem (≤ 12), number of base pairs in the stem region of the predicted hairpin (≥ 16), cutoff of free energy (kCal/mol ≤ -15), length of hairpin (up and down stems + terminal loop ≥ 50), length of hairpin loop (≤ 20), number of nucleotides in one bulge in mature region (≤ 8), number of biased errors in one bulge in mature region (≤ 4), number of biased bulges in mature region (≤ 2), number of errors in mature region (≤ 7), number of base pairs in the mature region of the predicted hairpin (≥ 12) and percent of mature sequences in stem (≥ 80). To predict the genes targeted by most abundant miRNAs, two computational target prediction algorithms TargetScan99,100,101 and Miranda 3.3a102 were used to identify putative miRNA binding sites. Finally, the data predicted by both algorithms were combined and the overlaps calculated. The R package, enrichplot, was used to visualize GO term enrichment from the 2,143 predicted target transcripts of the statistically downregulated miRNAs. These transcripts were trimmed to include only transcripts of the primary isoform of the gene and with p-values < 0.05. The KEGG pathway database was used to analyze the function of the predicted gene targets of the differentially expressed miRNAs103,104,105,106./p> 7 were used to construct the sequencing library. mRNA was purified from total RNA (5 µg) using Dynabeads Oligo (dT)(Thermo Fisher Scientific) with two rounds of purification. Following purification, mRNA was fragmented into short fragments using a NEB Next Magnesium RNA Fragmentation Module (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) at 94 °C for 5–7 min. Cleaved RNA fragments were reverse transcribed to cDNA by Superscript II Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) and the resulting cDNA used to generate U-labeled second-stranded DNA using E. coli DNA polymerase I, RNase H (both New England Biolabs) and dUTP Solution (Thermo Fisher Scientific). An A-base was added to the blunt ends of each strand, preparing them for ligation to the indexed adapters. Each adapter contained a T-base overhang for ligating the adapter to the A-tailed fragmented DNA. Dual-index adapters were ligated to the fragments, and size selection was performed with AMPureXP beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). U-labeled second-stranded DNAs were treated with heat-labile UDG enzyme (New England Biolabs), and ligated products were amplified with PCR by the following conditions: initial denaturation at 95 °C for 3 min; 8 cycles of denaturation at 98 °C for 15 s, annealing at 60 °C for 15 s, and extension at 72 °C for 30 s; and final extension at 72 °C for 5 min. The average insert size for the paired-end libraries was 300 bp (± 50 bp). Paired-end sequencing was performed on an Illumina Hiseq 4000 (Illumina, San Diego, CA, USA). Reads were adapter and quality trimmed using Trimmomatic107. HISAT2108 and StringTie109 were used to align surviving reads to the B. malayi reference genome (WormBase ParaSite version 12.4)110,111 and to the Ae. aegypti reference genome (VectorBase release 47)112 to produce raw counts for annotated genes./p>3.0.CO;2-E" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1521-4141%28200203%2932%3A3%3C858%3A%3AAID-IMMU858%3E3.0.CO%3B2-E" aria-label="Article reference 13" data-doi="10.1002/1521-4141(200203)32:33.0.CO;2-E"Article CAS PubMed Google Scholar /p>
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