박테리아 수축 주입 시스템을 이용한 프로그래밍 가능한 단백질 전달

Nature 616권, 357~364페이지(2023)이 기사 인용

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Endosymbiotic 박테리아는 이러한 유기체가 숙주 생물학과 인터페이스할 수 있도록 복잡한 전달 시스템을 진화시켰습니다. 한 가지 예인 세포외 수축성 주입 시스템(eCIS)은 세포막을 통해 스파이크를 유도하여 진핵 세포에 단백질 페이로드를 주입하는 주사기와 같은 거대분자 복합체입니다. 최근 eCIS가 마우스 세포를 표적으로 삼는 것으로 밝혀지면서1,2,3 이러한 시스템이 치료 단백질 전달에 활용될 수 있는 가능성이 높아졌습니다. 그러나 eCIS가 인간 세포에서 기능할 수 있는지 여부는 아직 알려지지 않았으며 이러한 시스템이 표적 세포를 인식하는 메커니즘도 제대로 이해되지 않았습니다. 여기서 우리는 곤충병원성 박테리아인 Photorhabdus asymbiotica의 eCIS인 Photorhabdus 독성 카세트(PVC)에 의한 표적 선택이 PVC 꼬리 섬유의 원위 결합 요소에 의한 표적 수용체의 특정 인식에 의해 매개된다는 것을 보여줍니다. 또한 꼬리 섬유의 in silico 구조 유도 엔지니어링을 사용하여 PVC가 인간 세포 및 생쥐를 포함하여 이러한 시스템의 원래 표적이 아닌 표적 유기체에 대해 100%에 가까운 효율성으로 재프로그래밍될 수 있음을 보여줍니다. 마지막으로 우리는 PVC가 Cas9, 기본 편집자 및 독소를 포함한 다양한 단백질 페이로드를 로드할 수 있고 기능적으로 이를 인간 세포에 전달할 수 있음을 보여줍니다. 우리의 결과는 PVC가 유전자 치료, 암 치료 및 생물학적 제어에 적용 가능한 프로그래밍 가능한 단백질 전달 장치임을 보여줍니다.

내공생 박테리아의 경우, 공생체 적합성을 위해 숙주 생물학을 조절하는 인자를 분비하는 것이 종종 유리합니다. 그러나 그러한 많은 요인들은 세포막을 쉽게 통과할 수 없습니다. 이로 인해 페이로드 단백질을 세포에 적극적으로 전달하는 복잡한 시스템이 개발되었습니다. 한 가지 예는 박테리오파지 꼬리를 닮은 주사기형 나노머신의 일종인 수축성 주입 시스템(CIS)입니다.

CIS는 베이스플레이트에 고정되고 스파이크 단백질8,9,10,11,12,13,14에 의해 날카롭게 되는 수축성 외피에 수용된 견고한 튜브 구조를 포함하는 거대분자 복합체입니다. 페이로드는 스파이크 뒤의 내부 튜브 내강에 로드되거나, 튜브와 융합 단백질을 형성하거나, 표적 세포 인식 시 외피 수축을 통해 막을 통과하는 스파이크 자체와 연관되는 것으로 생각됩니다. 16,17. CIS가 생명의 세 가지 영역 모두에서 유기체를 표적으로 삼는 것으로 나타났기 때문에 이 전략은 생물권 전반에 걸쳐 매우 성공적인 것으로 입증되었습니다12,18,19. CIS는 박테리아 막에 고정되어 VI형 분비 시스템8,20(T6SS)으로 알려진 접촉 의존형 전달 시스템을 만들거나 시아노박테리아(tCIS)의 틸라코이드 막에 부착되어 세포 스트레스 동안 활성화될 수 있습니다. 응답13; 마지막으로, 이들은 자유 복합체(eCIS)로 생산될 수 있으며 박테리아 생산자와 독립적으로 페이로드를 전달하기 위해 세포외로 방출될 수 있습니다. eCIS는 박테리아와 고세균 전체에 널리 분포되어 있으며 적어도 6개의 하위과로 클러스터링되는 것으로 나타났으며 그 중 2개만이 특징적인 예를 포함합니다21,22,23. eCIS 페이로드는 숙주 세포골격의 조절18,24, DNA 절단1, 변태 유도15,25 및 숙주 독성22,24,26을 포함하여 다양한 자연 기능을 나타내는 것으로 나타났으며, 이는 이러한 시스템이 여러 생물학적 틈새에 맞게 조정되었음을 나타냅니다. 최근 eCIS가 마우스 세포를 표적으로 삼는 것으로 밝혀지면서 이러한 시스템이 단백질 전달 도구로 활용될 수 있는 가능성이 높아졌습니다. 그러나 eCIS 활동은 아직 인간 세포에서 입증되지 않았으며 eCIS가 표적 세포를 인식하는 메커니즘(이러한 시스템을 표적 전달 장치로 개발하려는 경우 필수)은 아직 밝혀지지 않았습니다.

eCIS 활동에 대한 연구를 위해 우리는 eCIS의 하위 유형 중 하나인 PVC에 중점을 두었습니다. PVC는 곤충병원성 선충 내에서 내공생체로 존재하는 Photorhabdus 속의 구성원에 의해 생산된 eCIS입니다. PVC는 기능성 주입 시스템의 조립에 필요한 16개의 핵심 유전자(pvc1-16)를 포함하는 약 20kb의 오페론으로 구성됩니다(그림 1a). pvc1-16의 바로 하류에는 모든 eCIS와 마찬가지로 페이로드 Pdp1과 Pnf가 있으며, 이는 PVC 외피의 수축과 그에 따른 스파이크-튜브 복합체의 분해를 통해 표적 세포로 들어가는 것으로 생각됩니다(그림 1b).

95%) and are drawn roughly to scale. Scale bar, 100 aa. b, Pvc13 is loaded via the NTD, implicating the C-terminal phage fibre tip domain as the cell-binding domain. Pvc13 was truncated at either end and loading was determined via denaturing western blot on purified PVC particles. Only truncation of the NTD resulted in a loss of Pvc13, suggesting this domain connects the tail fibre to the PVC. An additional blot against the payload (Pdp1-NTD–Cre) was included to confirm the presence of assembled PVCs. c, The C-terminal phage fibre tip domain of Pvc13 shares structural and sequence similarity with known receptor-binding domains from bacteriophages. Structural superpositions were generated between the phage fibre tip domain from Pvc13 (in grey) and analogous regions from a prophage tail fibre in Bizionia argentinensis (cyan; PDB: 6OV6), gp10 from phage T4 (magenta; PDB: 5IV5) and gp12 from phage T4 (yellow; PDB: 5HX2). d, Predicted structures and delivery characteristics of wild-type and engineered PVC tail fibres. The AlphaFold predicted structure of the C-terminal phage fibre tip domain contains a helical tube structure with a globular tip on one end that we hypothesized to be the distal target recognition domain of the overall tail fibre. Importantly, there also exists a short 32 aa region (labelled CTD; depicted in gold) that loops back through the tube, likely stabilizing it. We observed that designs lacking this CTD (when co-purified with the PVC complex) produced misleading activity in Cre delivery experiments in HEK 293FT, perhaps as a result of sporadic ejection of the Cre payload from the PVC particle (free Cre protein can enter cells independently of a delivery vehicle50). However, designs retaining this CTD produced no aberrant signal in HEK 293FT, indicating payload ejection was once again properly regulated. Amino acid sequences for representative Pvc13 designs can be found in Supplementary Tables 1–4. Scale bar, 150 μm./p>

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